八尾 寛

本研究は、ランタニドナノ粒子(LNP)とチャネルロドプシン(ChR)などの光受容タンパク質を最適化し、両者を神経回路モデルで評価することで、生体透過性に優れた近赤外光で、神経細胞活動を操作する基盤技術を開発することを目的とする。日本側において、光受容タンパク質を改変し、感度やナノ粒子との接着性を高め、相手国側において、アップコンバージョン効率を高める。最適化されたナノ粒子と光受容タンパク質を、相手国側において脊髄神経回路に応用し、歩行パターン発生回路の近赤外光駆動を評価する。日本側は、ナノ粒子の表面修飾や光受容タンパク質の改変において優れ、相手国側は、ナノ粒子の開発や動物実験において優れているので、相乗効果が期待される。両国チームによる共同研究を通して、脳・脊髄など中枢神経深部の神経細胞を低侵襲で近赤外光操作するバイオ・ナノデバイスシステムの基盤技術の確立が期待される。生物由来の光受容タンパク質は、可視光に応答するが近赤外光に反応しない。650–1450 nmの近赤外光は、可視光に比べ組織透過性に優れている。LNPのアップコンバージョンとChRの組合せは、提案者らの先行研究では、効率が約0.000001%と極めて低い。本研究は、その効率を0.001%以上に高めることにより、近赤外光を用い神経活動を非侵襲で自在に操作することを可能とするものである。

A recent innovation driven by optogenetics enables one to investigate the performance of a neuronal network with cause-effect relationship (Yawo et al., 2015). When light-sensitive cation channels such as ChR2 are expressed in a neuron, whether the neuron is sufficient for the network performance could be determined on the basis of light-dependent changes in the activity of the neuron. On the other hand, neurons expressing a light-driven Cl- pump (eg. NpHR) or a light-driven H+ pump (eg. ArchT) become hyperpolarized by yellow light with the reduction of their activity. As a result, it could be determined whether a neuron in question is necessary for the network performance of the behavioral expression. Applying both positive and negative manipulations together, it is possible to clarify the necessary and sufficient conditions. Here, we showed that one of light-driven Na+ pumps, KR2, which is derived from a marine flavobacterium Krokinobacter eikastus (Inoue et al., 2013; Kato et al., 2015), is a novel optogenetic bioactuator for the stable hyperpolarization of membrane potential. Rat cortical neurons were cultured and transfected to express a human codon-optimized KR2 gene fused wi

ヒトは触覚などの体性感覚を介して、外界のさまざまな情報をえている。しかし、ものの形、大きさ、運動、手触りなどの複合的な触覚情報が、脳内においてどのように処理されているかについての研究は、ほとんどなされていない。本研究においては、三叉神経節機械受容ニューロン特異的にチャネルロドプシン2を発現するラットを用い、触覚パターンに応答する脳領域を同定することを目的とする。当該ラットにおいては、頬ひげ（ウィスカ）の毛包に分布する機械受容神経終末にチャネルロドプシン2が高密度に分布しているので、大脳皮質バレル野において、ウィスカ毛包光刺激による応答が計測される。そこで、チャネルロドプシン2トランスジェニックラットのウィスカ基部と青色LEDをプラスチック光ファイバーでつなぐ。LEDの点滅をコンピューターD/A変換によりソフトウェア制御し、４×４（計16チャネル）の光刺激マトリクスパターンを作成する。小動物用7T-MRI装置を用いたfMRIにより、光刺激パターンに依存したBOLD信号を抽出する。これを解析することにより、各々のマトリクスパターン入力に対応する脳領域を同定する。本研究は、チャネルロドプシン2などを利用したオプトジェネティクスと光による時間・空間的パターン刺激をfMRIと組み合わせた独創的なシステムを開発するものであり、脳の機能構築研究のブレークスルーになるとともに光科学技術の向上に寄与する。本研究を嚆矢として、体性感覚におけるパターン認識の生理学という未知の領域の研究が進展することが期待される。

非侵害性の触刺激により痛みが誘発されるアロディニアは、神経障害性疼痛の主症状の一つで、モルヒネなど鎮痛薬にも抵抗性を示す場合があり、その発症維持メカニズムの解明と有効な治療薬の開発は重要な課題である。神経障害後にAβ線維の刺激で疼痛が誘発されるかどうか大型神経選択的にChannelrhodopsin-2 (ChR2)を発現するトランスジェニックラット(W-TChR2V4ラット)を用いて検討する。

脳のニューロンの活動が高次機能を作り出しているしくみを解明するにあたり、個々のニューロンの活動とその操作を、ネットワークの活動や動物行動と関連付けながら、双方向的に解析することが重要です。これを行うにあたり、光受容能のある機能分子を遺伝子工学的に目的の細胞に組込み、光学的にこれを制御する手法（オプトジェネティクス、光遺伝学）と光の出力と電気の多点入力をあわせ持つ双方向プローブを一体化したシステムを開発します。

緑藻類クラミドモナスが持つ光受容イオンチャネル遺伝子を網膜の残存する細胞に導入することにより、光受容能を与えるというものである。この様式から遺伝子導入された個々の細胞が光受容細胞になると考えられる。現在までの研究で、1回の眼内注射で約28万個の細胞に光受容能を与えることが可能であることが明らかとなっている。人工網膜の100あるいは1000画素に対し、この方法では1回の眼内注射で28万画素相当という遙かに高い解像度が期待できる。また、その光受容のメカニズムも元来の神経細胞が持つ、興奮、神経パルスの発生という本来の網膜における光受容伝達様式であることも大きな特徴である。しかし、ヒトへの応用を考えた場合、大きな問題点がある。遺伝子治療という範疇から、高等動物でこの治療法の安全性を明確に示す必要がある。

前頭連合野は、皮質下の基底核、小脳、海馬、扁桃体との間に機能連関し、動作制御、認知的行動制御に関わっている。特に意思決定に関しては、記憶（海馬）、情動（扁桃体）、認知的習慣（基底核）などのさまざまな情報の統合が大事である。申請代表者の行ってきた前頭連合野の情報表現は、固定的なものでなく、行動文脈依存的であり、さらに動的変化することが見出された。このような動的状態変化のメカニズムを理解するにはシステムとしての安定性（アトラクター）や状態遷移という捉え方が必須であるとの考えに到った(Sakamoto, Mushiake et al 2008; Mita, Mushiake et al 2009)。前頭連合野と機能連関のある海馬、基底核、そして扁桃体も、それぞれ、局所回路として独自に状態とその遷移の動作原理があることが示唆されている。特に抑制性の細胞の多様性とその意義が、皮質、海馬、扁桃体で議論されており、抑制性細胞と興奮性細胞の活動が各システムでの回路の安定と状態遷移の神経基盤と考えられる。そこで、本研究では、中枢神経ネットワークのモデルシステムとして、前頭連合野（虫明）、海馬（八尾）、扁桃体（柳川）、基底核（小山内）にフォーカスし、興奮性抑制性の相互作用とそれによる動的状態遷移のメカニズムを解明し、回路の安定性と状態遷移を作り出す共通の基盤原理を見出すことを第一の目標とする。さらに、部位特異的な状態制御機構の解明を第二の目標とする。

これまで行った共同研究から、グリア細胞と神経細胞との接触によって生じる神経細胞の成熟促進という現象を探る上で重要な知見を得た。現象のメカニズムを高い精度で測定するために必要な新たなアプローチ法を開発しつつあり、研究をより詳細かつ正確なものにする。