小脳は運動制御を司る重要な器官である。小脳皮質を構成する主要な神経細胞である小脳顆粒細胞は、苔状線維からの入力を統合し、平行線維を通じて信号を出力することにより、小脳が機能的に働くことに大いに寄与している。本研究では、顆粒細胞分化の初期過程における分子機構を解明すべく、顆粒細胞の分化開始に必須の転写因子であるMath1に着目し、その下流で働く遺伝子群の同定とその機能解明に取り組む。今年度は、交付申請書の研究実施計画に沿って、前年度から着目しているMath1下流候補遺伝子Mbh1の機能解析を推進すると共に、更なる下流遺伝子の同定を目指した。
1.マウス生体内遺伝子導入法によるルMbh1の機能解析
顆粒細胞の分化の初期過程においてMbh1の機能を探るため、申請者の研究室で既に報告しているMbh1のドミネガ体をコードする遺伝子を、生体内遺伝子導入法を用いてマウス胎児の小脳へ導入した。ドミネガ体が導入された小脳では、外顆粒層の形成が阻害されるなど顆粒細胞の分化に異常が見られた。この結果はMbh1が顆粒細胞の分化に関与している可能性を示唆している。
2-a.Math1強制発現系を用いた、Math1下流遺伝子群の同定
Math1を小脳に異所的に発現させることにより誘導される遺伝子群を探索した。その結果、前年度から着目しているMbh1に加え、同じファミリーに属するMbh2など小脳で発現する幾つかの遺伝子の誘導が観察された。
2-b.Mbh2の発現制御機構の解析
小脳顆粒細胞へのMath1 siRNAsの導入により、Mathlの発現低下に伴い、Mbh2の発現が低下することを示した。またクロマチン免疫沈降法により、Math1がMbh2のゲノムの3'領域に結合していることを示し、Mbh1と同様にMbh2もMath1の標的遺伝子であることを明らかにした。