共同研究・競争的資金等の研究課題

2018年4月 - 2021年3月

MMP-2欠損マウスの硬組織デグラドームを利用した石灰化制御基質タンパクの探索

日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)
  • 笹野 泰之
  • ,
  • 鈴木 治
  • ,
  • 矢尾 育子

課題番号
18K09517
配分額
(総額)
4,290,000円
(直接経費)
3,300,000円
(間接経費)
990,000円

骨と象牙質の石灰化に際しMMP-2で分解される「石灰化制御基質タンパク」を探索することを本研究の目的とする。MMP-2デグラドーム(MMP-2酵素で分解されるタンパクとその分解産物のプロテオーム)をMMP-2欠損マウスと野生型マウスのプロテオームを比較検討することで明らかとする。この際、プロテオームは質量顕微鏡を用いて可視化し、MMP-2欠損で残存し野生型で消失するタンパクを「石灰化制御基質タンパク」として抽出する。また、骨と象牙質のミネラル結晶の特性を解析し、MMP-2欠損における石灰化に関連する表現型も併せて検討する。平成31年度では、MMP-2欠損マウス(GelA KO)を理研バイオリソース研究センター(理研BRC)から導入し、本学の動物実験施設における検疫を経て、繁殖を開始した。Mmp2-/-のメスは正常な分娩が行えないことから、Mmp2+/-の掛け合わせにより繁殖した。理研BRCの情報に基づき、遺伝子型決定のためのPCR条件の検討を行った。その結果、野生型配列の検出にはGelA Forward(5’-GTGCTACTGCAGGATAAACTGATG-3’)とGelA Reverse(5’-CCGGGACAGGAACGTACTGGGTTC-3’)のプライマーを用い、94℃ 2分の熱変成の後、98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 60秒の3ステップを30サイクル繰り返し、さらに72℃ 10分の伸長反応を行う反応条件を設定した。ノックアウト配列の検出には、GelA ForwardおよびPGKF(5’-CCGGGACAGGAACGTACTGGGTTC-3’)のプライマーを用い、94℃ 2分の熱変成の後、98℃ 10秒、58℃ 30秒、68℃ 60秒の3ステップを30サイクル繰り返し、さらに72℃ 5分の伸長反応を行う条件とした。