基本情報

所属
山口大学 大学院 医学系研究科 保健学専攻 病態検査学講座 講師
学位
博士 (医工学)(山口大学)
通称等の別名
Otsuyama K, Otsuyama K-I
研究者番号
10432741
J-GLOBAL ID
201801004388749796
researchmap会員ID
7000021995
外部リンク

研究キーワード

  1

研究分野

  2

経歴

  5

主要な学歴

  3
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主要な受賞

  2
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主要な共同研究・競争的資金等の研究課題

  15
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論文

  41
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学術貢献活動

  1

講演・口頭発表等

  94
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MISC

  38
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主要な書籍等出版物

  9
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担当経験のある科目(授業)

  33
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所属学協会

  3

その他

  2
  • １．ヒト骨髄種細胞株における恒常的NF-kB活性を検討する。 <br>1)ヒト骨髄種細胞株(U266, AMO1, NOP2)から核分画を抽出する。LightShift&reg; Chemiluminesecent EMSA kit(PIERCE社)を用いて、kB siteを有するDNA断片にBiotin(non-RI)で標識し、NF-kBのいずれのサブユニットがkB siteと結合をしているのかゲルシフト(EMSA)における特異抗体による影響で解析する。<br>2)上記の核分画を用いて、TransAMTM Flexi NF-kB Family kit(Active Motif社)でNF-kBのELISAを行い、ゲルシフトアッセイ同様NF-kBのいずれのサブユニットがkB siteと結合をしているのか解析する。<br>3)上記の核分画及び細胞質分画を用いて1)，2)の結果からNF-kBサブユニットのホモ及びヘテロ二量体の確認をWestern blotおよび免疫沈降(Immunoprecipitation)-Western blotで解析する。<br>4)ヒト骨髄種細胞株(U266, AMO1, NOP2)を用いて、抗NF-kBサブユニットをそれぞれ染色し、それぞれの細胞での局在を共焦点レーザー顕微鏡(LSM510, Carl-Zeiss社)(現有設備)で解析する。<br>5)ヒト骨髄種細胞株(U266, AMO1, NOP2)から常法のごとくRNA抽出し、NF-kB標的遺伝子(XIAP, Bcl-xL, CyclinD1, Survivinなど)を定量PCR(Q-PCR)で発現解析する。<br>6)上記1)で確認されたNF-kBサブユニットから、そのsiRNAをヒト骨髄種細胞株へNucleofectorTM(amaxa)で感染させ、その増殖・生存に及ぼす作用をフローサイトメーター(Epics Elite ESP, Beckman Coulter社)（現有設備）で解析する（生細胞数を測定する）。<br>２． 患者骨髄腫細胞における恒常的NF-&＃61547;B活性を検討する。 1) 骨髄腫50例、MGUS 15例、多クローン性γグロブリン血症 10例につき、患者インフォームドコンセントの下、骨髄穿刺を施行する。<br>2) 骨髄穿刺液中に形質細胞が80%以上の検体は、骨髄単核球分画をそのまま使用する。形質細胞比率が80%以下の検体は、FITC標識CD38とPE標識CD19抗体(Beckman Coulter社)で染色後、セル・ソーター(Epics Elite ESP),で形質細胞を分取して使用する。<br>3) 細胞数が可能な限り、上記１．1)、2), 5)、3), 4) の順に解析を行う。<br>３．患者骨髄腫細胞におけるCD54等の発現解析とin vitr
  • １．ヒト骨髄種細胞株における恒常的NF-kB活性を検討する。 <br>1)ヒト骨髄種細胞株(U266, AMO1, NOP2)から核分画を抽出する。LightShift&reg; Chemiluminesecent EMSA kit(PIERCE社)を用いて、kB siteを有するDNA断片にBiotin(non-RI)で標識し、NF-&＃61547;Bのいずれのサブユニットが&＃61547;B siteと結合をしているのかゲルシフト(EMSA)における特異抗体による影響で解析する。<br>2)上記の核分画を用いて、TransAMTM Flexi NF-kB Family kit(Active Motif社)でNF-&＃61547;BのELISAを行い、ゲルシフトアッセイ同様NF-kBのいずれのサブユニットが&＃61547;B siteと結合をしているのか解析する。<br>3)上記の核分画及び細胞質分画を用いて1)，2)の結果からNF-&＃61547;Bサブユニットのホモ及びヘテロ二量体の確認をWestern blotおよび免疫沈降(Immunoprecipitation)-Western blotで解析する。<br>4)ヒト骨髄種細胞株(U266, AMO1, NOP2)を用いて、抗NF-kBサブユニットをそれぞれ染色し、それぞれの細胞での局在を共焦点レーザー顕微鏡(LSM510, Carl-Zeiss社)(現有設備)で解析する。<br>5)ヒト骨髄種細胞株(U266, AMO1, NOP2)から常法のごとくRNA抽出し、NF-kB標的遺伝子(XIAP, Bcl-xL, CyclinD1, Survivinなど)を定量PCR(Q-PCR)で発現解析する。<br>6)上記1)で確認されたNF-kBサブユニットから、そのsiRNAをヒト骨髄種細胞株へNucleofectorTM(amaxa)で感染させ、その増殖・生存に及ぼす作用をフローサイトメーター(Epics Elite ESP, Beckman Coulter社)（現有設備）で解析する（生細胞数を測定する）。<br>２． 患者骨髄腫細胞における恒常的NF-&＃61547;B活性を検討する。 1) 骨髄腫50例、MGUS 15例、多クローン性γグロブリン血症 10例につき、患者インフォームドコンセントの下、骨髄穿刺を施行する。<br>2) 骨髄穿刺液中に形質細胞が80%以上の検体は、骨髄単核球分画をそのまま使用する。形質細胞比率が80%以下の検体は、FITC標識CD38とPE標識CD19抗体(Beckman Coulter社)で染色後、セル・ソーター(Epics Elite ESP),で形質細胞を分取して使用する。<br>3) 細胞数が可能な限り、上記１．1)、2), 5)、3), 4) の順に解析を行う。