手術で治療目的に摘出された副腎から患者の承諾得て副腎髄質を入手した。
ヒト副腎髄質から、内因性麻薬用物質enkephalinの前駆体であるPre-pro-enkephalinのtotal RNAを抽出した。NIHの配列情報からPre-pro-enkephalinの完全長を含む塩基配列を増幅するため、5'側の翻訳開始領域がコザック配列をもつようにプレイマーを設計した。上記で抽出したtotal RNAからcDNAを合成し、cDNAを鋳型としてPCRを行った。
上記プレイマーを用いて、目的とするPre-pro-enkephalinの遺伝子を増幅した。
増幅した断片をウイルスベクター(pDON-AI-2-Neo骨格とpMEI-5Neo [Not I-BamHI]骨格)に挿入した。
感染効率はpDON-AI-2-Neo 10倍希釈で55.83%、pMEI-5 Neo 10倍希釈で8.89%であり、ウイルスベクターの基本骨格としてpDON-AI-2-Neoを選択することにより実験効率を向上しうることが判明した。
研究対象はレンチウイルスとレトロウイルスであるが、まずレトロウイルスを用いた研究を先行させた。
挿入したPre-pro-enkephalinの遺伝子の塩基配列を確認した。
細胞へのトランスフェクション法を用いた組み換えレトロウイルスの産生と組み換えレトロウイルス産生細胞の完成および動物を用いた治療効果の判定が課題である。