五味 勝也

菜種油粕を再資源化するために必要な複合酵素を大量生産する技術の実用化開発を行う。セルフクローニングにより複合酵素遺伝子を高発現する麹菌を取得し、大型化した固体培養装置により複合酵素を安価、効率的かつ安全に大量生産する。

物質生産の鍵となる生育環境の感知から遺伝子発現に至る分子メカニズムについて明らかにし、その理解をもとに、培養環境シグナルの感知や遺伝子発現の制御システムに分子レベルで人為的改変を加え、液体・固体のいずれの培養条件にも適応した汎用的な物質生産制御技術の開発を目指す。 （中課題「固体培養制御に向けた転写制御マシナリーの解明と新規シグナル伝達系の創出」の分担）

セルロース系バイオマスの分散型超高効率エタノール生産システムの開発を行う。

麹菌またはクモノスカビの乳酸脱水素酵素遺伝子を、有機酸生産能の高い黄麹菌と黒麹菌に導入し、高発現させることにより、安価に乳酸を生産するプロセスを開発している。

１．麹菌ゲノム情報より転写調節因子をコードする遺伝子の抽出 麹菌のゲノム情報を基にして、既知の転写調節因子との相同性を指標に麹菌の転写調節因子遺伝子を抽出し、正確な遺伝子領域の推定を行った。このうち5’端を推定できなかった遺伝子はRACE法により遺伝子末端の決定を行った。 ２．転写調節因子の発現を個別に強化した麹菌ライブラリーの作製 1で抽出した推定遺伝子を順次PCR法で増幅し、麹菌での発現プラスミドを構築する。このプラスミドで麹菌を形質転換し、個々の転写調節因子の発現が強化された麹菌のライブラリーの作製を目指しており、現在ライブラリーの作製は順調に進行している。 ３．DNAマイクロアレイの作成 本事業では強制発現株の解析を行うためDNAマイクロアレイの作製を行った。麹菌で発現が実験的に確かめられている遺伝子すべてを搭載したｃDNAマイクロアレイ等を本年度中に作製した。 ４．転写調節因子遺伝子の発現を強化した麹菌の解析 転写調節因子遺伝子の発現を強化した麹菌の解析は１）DNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析、２）2次元電気泳動法を用いたプロテオーム解析、３）動植物たんぱく質分解活性測定によるたんぱく質分解活性解析で行うこととし、その方法を確立した。 ５．転写ネットワークデータベースの作製と評価－マイクロアレイデータ管理・解析支援システム開発 膨大な解析データの処理を行い、多くの研究機関がデータ、解析システムを共有するためにインターネット経由で利用できるシステムの構築が必要である。そのためシステムの設計を行った。

麹菌による生分解性プラスチックのバイオケミカルリサイクル技術の開発を実施している。

麹菌に存在するトランスポゾン（class Iおよびclass II）をゲノム解析およびEST解析データより検索し、その構造を明らかにした。また、class Iに属するレトロトランスポゾン5種類を用いて麹菌（Aspergillus oryzae）に近縁のカビにおける分布を調べたところ、最も進化的に近いと考えられた野生種（A. flavus）には存在せず、醤油麹菌（A. sojae）のみに分布が認められたことから、醸造現場でA. oryzaeとA. sojaeが混合利用された際にトランスポゾンの転移が起こった可能性が示唆された。

醤油醸造から副生する醤油搾り粕の低減化を目的として、醤油搾り粕分解酵素の探索ならびにその遺伝子を高発現させることを目指した研究を実施している。

バイオマス分解酵素遺伝子発現モニタリングデバイスとして、麹菌のEST解析により得られた遺伝子情報をもとに、約2,000個のcDNAを搭載したマイクロアレイを作製し、固体培養ならびに液体培養における遺伝子発現プロファイルの網羅的解析を可能にした。

麹菌のclass IIのトランスポゾンをゲノムより探索し、その構造解析を行った。特に、α-アミラーゼ遺伝子の下流に見出されたトランスポゾンはこれまで知られているものとは異なり、トランスポゼース遺伝子が末端反復配列の間に存在せず、その上流に飛び出した状態で存在することを明らかにした。本トランスポゼース遺伝子を高発現用プロモーターに連結して、麹菌に導入したところ、わずかではあるが形態が親株とは異なった表現型を示した。しかし、トランスポゾンの転移は認められなかった。

【マルトース資化遺伝子クラスター】 マルターゼ遺伝子（malT）を含むファージクローンの10-kbのDNA断片についてシークエンスした結果、マルトース・パーミアーゼ（malP）、マルターゼ（malT）、さらに転写因子に典型的なzinc binuclear motifを有するタンパク質をコードする遺伝子（malR）の３個の遺伝子がクラスターを形成していることが判明した。malPとmalTは、約1-kbのプロモーター領域を共有して逆方向に転写されており、malRはmalTのstop codonの下流約200 bpという非常に近い領域にそのORFが存在していた。また、これら３個の遺伝子ともにORF内にイントロンを有していなかった。MalPpは酵母のマルトースパーミアーゼに高い相同性を示し、12個の疎水性の高い膜貫通領域が存在しており、膜に局在してマルトースの細胞内への取り込みに関与するものと考えられた。また、MalTpはシグナルペプチド様配列を持たず、細胞内酵素であると考えられる。高発現用プロモーターによりmalTを麹菌で発現させると、菌体内に高いα-グルコシダーゼ活性が認められたので、本遺伝子は機能のあるα-グルコシダーゼをコードしていることが分かった。malTは野生株とamyR遺伝子破壊株ともにマルトースの存在下で発現が認められたことから、発現にamyRは関与していないと考えられる。MalRpのzinc finger motifはAmyRpやMAL63と高い相同性を示したが、タンパク質全体で比べるとそれほど相同性が高いわけではなかった。 【糖資化関連遺伝子クラスター】 もう１種類のクローンには、A. parasiticusのsugar utilization gene clusterで認められたヘキソースパーミアーゼ（hxtA）、α-グルコシダーゼ（glcA）、さらに転写因子（sugR）の遺伝子群がクラスターを形成していた。これらはいずれもアミノ酸レベルで90%以上の相同性を示し、麹菌のcounterpartと考えられる。このクラスターのすぐ上流にはNADHオキシダーゼ（nadA）遺伝子に相同性が高い配列が見出されたが、推定コード領域内に塩基の欠失や挿入などが認められ、機能しない偽遺伝子であると考えられる。また、さらに上流にはcypX、moxY、stcQに相当する遺伝子が存在したが、このうちstcQも塩基の欠失があって機能していないものと思われる。A. parasiticusではcypX-moxY-stcQがアフラトキシン生合成系遺伝子クラスターの末端領域にあることから、麹菌でも今回見出された糖資化関連遺伝子クラスターはアフラトキシン生合成系のクラスターに隣接しているものと考えられる。今のところこのクラスターの遺伝子の発現は認められていないが、今後条件を詳細