本研究は、DNA二重鎖切断(DSB)のセンサーであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK) が何をしているのか、何のために存在するのかを明らかにすることを目的としている。
(1)XRCC4のリン酸化の意義の解明を進めるため、今年度新たにヒト細胞からゲノム編集技術を用いてXRCC4欠損細胞を樹立した。これにXRCC4のリン酸化部位欠損変異体を導入することで、DSB修復に関する種々の機能解析を試みた。機能解析手法の一つとして、in vitroで種々の制限酵素で切断したGFP発現ベクターを細胞に導入し、蛍光を指標としてDSB結合能を測定する新たな系を確立した。その結果、変異によってDSB結合能が減少するものと増加するものが見出され、DSB結合を促進するリン酸化部位と抑制するリン酸化部位が明らかになった。(2)XRCC4の二量体及び多量体のそれぞれについてCD（円二色性）スペクトル測定を実施した。その結果、二次構造のうちβストランドの量が多量体化に大きく関与すること、またC末端側にあるリン酸化サイトをアスパラギン酸置換してリン酸化を擬似するとβストランドの量が増加することを突き止めた。(3)XRCC4の結合分子として、DNA末端のリン酸基の付加・除去を行うPNKPおよびアデニル基の除去を行うAPTXの種々の変異体を作製し、放射線、薬剤感受性、γ-H2AX、53BP1フォーカスなどを指標とした機能解析を行った。また、レーザー照射部位への集積を指標としてDNA損傷部位への動員を解析し、変異の影響やDNA-PKおよびXRCC4依存性の有無を明らかにした。(4)がんリスクとの相関が報告されているXRCC4バリアントについて、放射線感受性、γ-H2AXフォーカスなどを指標とした機能解析を行い、DSB修復機能が低下していることを明らかにした。また、レーザー照射部位への集積を指標として、DNA損傷部位への動員の低下も明らかにした。