共同研究・競争的資金等の研究課題

2003年 - 2004年

特異的タンパク質ノックダウン法を用いた細胞外基質と骨形成シグナルの相互作用の解析

文部科学省  科学研究費補助金(萌芽研究)
  • 田村 正人

課題番号
15659441
担当区分
研究代表者
配分額
(総額)
3,100,000円
(直接経費)
3,100,000円
(間接経費)
0円
資金種別
競争的資金

マウス筋芽細胞であるC2C12細胞を培養し本研究に用いた.この細胞にBMP2を加えて培養するとアルカリフォスファターゼ(ALP)活性が増加するとともに,骨芽細胞に特異的なオステオカルシンの発現が誘導され,骨芽細胞へ分化しうる.ノーザンプロット法を用い細胞接着因子のmRNA発現を検討したところ,E-カドヘリンならびにα5 integrinの発現が見られた.カドヘリンの細胞内裏打ちタンパク質であるβ-cateninはLef/Tcf1と結合してDNAに結合し転写調節の機能も有している.そこで,Lef/Tcf1応答領域レポーター(pTOP-FLASH)をC2C12細胞にトランスフェクトした.GSK-3によるリン酸化部位を欠失させた活性型β-cateninもしくはWnt3aを導入すると,pTOP-FLASHの活性は増大した.他方,non-canonical WntであるWnt-5aによっては,その活性は増加しなかった.Wnt3aと同時にBMP2を添加したところ,その活性は低下した.これらの結果から,C2C12細胞においてもWntのcanonical経路が存在しBMP2はこれに抑制的に機能することがわかった.RNAiを用いたノックダウンを行うために,α5 integrin等のインテグリンやGSK3βの一部のmRNA配列相当の合成ヌクレオチドをU6プロモーターベクターに挿入したコンストラク...

リンク情報
URL
http://kaken.nii.ac.jp/d/p/15659441.ja.html