ミトコンドリアタンパク質の多くは,サイトゾルで前駆体として合成された後,ミトコンドリア外膜と内膜の膜透過装置の働きで,外膜と内膜を通過して,ミトコンドリア内部に移行する。本研究では,部位特異的に光架橋性の非天然アミノ酸(ベンゾイルフェニルアラニン誘導体)を導入した前駆体を用いて,膜透過装置との相互作用の解析を行い,タンパク質のミトコンドリア膜透過の仕組みを明らかにすることをめざした。
サプレッサーtRNA法を用いて,プレ配列を持つ前駆体のプレ配列中の様々な部位に,光反応性の非天然アミノ酸残基を部位特異的に導入したミトコンドリアタンパク質前駆体を系統的に調製した。この前駆体と膜電位を消失させたミトコンドリアをin vitroでインキュベートすることによりミトコンドリア外膜透過反応中間体を生成し,光照射によって架橋反応を行った。架橋産物について,架橋の相手を既知の膜透過装置構成タンパク質に対する抗体による免疫沈降実験により,同定した。以上の解析の結果,プレ配列の外膜透過は,これまで考えられていたような成熟体部分のunfoldingとは共役する必要がないことが明らかになった。続いて,消失させた膜電位を復活させることにより,外膜膜透過反応中間体の内膜通過を促し(チェイスし),これまで論争が続いていたTom22の膜間部ドメインの役割について検討した。その結果,Tom22の膜間部ドメインは,外膜膜透過装置から内膜膜透過装置への前駆体の引き渡しの効率を高めていることが明らかになった。これらの結果は,アミノ酸残基レベルの空間分解能を有する部位特異的光架橋反応を行うことによって初めて解明することができたものである。さらに同様の手法をキャリアタンパク質のミトコンドリア内膜への移行,タンパク質の葉緑体包膜透過の実験系にも適用した。