2017年4月 - 2020年3月
酵素-RNA複合体を用いた新規細胞内変異RNAの修復法の開発と応用
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
本研究では、遺伝子の点変異を原因とする疾患に対する治療法として、発現している変異したRNAの変異を人工酵素複合体の導入によって部位特異的に脱アミノ化/アミノ基付加を行うことで遺伝コードを修復し、疾患を治療する方法の確立を目的としている。具体的にはRNA editingを触媒するADARファミリーのADAR1及びAPOBECファミリーのAIDの活性部位をMS2システムを介してguide RNAと結合させる事で任意の標的RNAのAまたはCを脱アミノ化し、A⇒I (G)およびC⇒Uの変換を触媒する人工の酵素-RNA複合体を創成する。さらに、AIDへの変異導入によってアミノ基付加反応(即ちU⇒C)を触媒する酵素の創成を目指して研究を行う。植物ではU⇒CのRNA editingも広く存在しているが、本研究ではAIDの変異誘導によって同様の活性の実現を図る。
ADAR1活性部位による変換酵素については、既に人工酵素複合体によるRNA修復に成功していた。H29年度はより変換効率を向上させるため、guide RNAのMS2 RNAを6Xからより強く結合する12Xに変更したguide RNAを作成した。ナンセンス変異を導入したEGFPを基質としてRNA修復を試みたところ、わずかではあるが修復効率の向上がみられた。さらなる向上のため、部位同士を結合するリンカー配列の最適化を試みている。
一方、AIDについてはPCRクローニングにより活性部位断片を単離し、MS2タンパク質との融合タンパク質プラスミドを構築した。また基質としてGFP遺伝子のT⇒U変異がBFPとなる系を利用し、guide RNAの構築も行った。さらに、AIDにアミノ基付加活性を持たせる目的で塩基性アミノ酸を導入可能なアミノ酸を絞り込むため、ファミリー酵素であるAPOBECファミリーの活性部位の3次元構造の比較検討を行った。
ADAR1活性部位による変換酵素については、既に人工酵素複合体によるRNA修復に成功していた。H29年度はより変換効率を向上させるため、guide RNAのMS2 RNAを6Xからより強く結合する12Xに変更したguide RNAを作成した。ナンセンス変異を導入したEGFPを基質としてRNA修復を試みたところ、わずかではあるが修復効率の向上がみられた。さらなる向上のため、部位同士を結合するリンカー配列の最適化を試みている。
一方、AIDについてはPCRクローニングにより活性部位断片を単離し、MS2タンパク質との融合タンパク質プラスミドを構築した。また基質としてGFP遺伝子のT⇒U変異がBFPとなる系を利用し、guide RNAの構築も行った。さらに、AIDにアミノ基付加活性を持たせる目的で塩基性アミノ酸を導入可能なアミノ酸を絞り込むため、ファミリー酵素であるAPOBECファミリーの活性部位の3次元構造の比較検討を行った。
- ID情報
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- 課題番号 : 17H02204
- 体系的課題番号 : JP17H02204