北澤 春樹

経口摂取したセロトニンの抗肥満作用発現に関わる標的臓器およびセロトニンにより誘導される新規な生体内エネルギー代謝機構を明らかにし、食品としてのセロトニンの健康機能性を解明する。さらに、抗体法を用いて農業現場で測定可能な農産物セロトニン含有量の簡易測定法を開発し、ゲノム情報を利用してセロトニン高含有するトマトを開発する。

潰瘍性大腸炎やクローン病に代表される炎症性腸疾患(IBD)は、年々激増し続けており難病疾患に指定されている。その主たる原因として、微生物のパターン認識受容体(PRR)を介する腸管上皮細胞の異常応答と腸管免疫機能低下が上げられ、Quality of Life (QOL)を著しく低下させることから大きな社会問題となっている。このQOLの向上のためには，腸管局所で上皮細胞異常と免疫機能低下を予防・改善する機能性食品や製剤の開発が求められている。 本研究では、これまでの我々の知見（項目５を参照）を基礎として、食生活面からのアプローチにより、炎症性腸疾患予防・改善を可能とする「イムノバイオティック食品」の開発基礎を築くため、腸管上皮細胞において抗炎症性を発揮するイムノバイオティクスの選抜と、PRRを介する抗炎症性機構について解明する。

【背景】 ラッキョウ漬けにおいて、乳酸菌発酵は、「旨み」を向上させることができるため、その製造工程にかかせないものとなっている。乳酸菌の中でも、Lactobacillus plantarum（いわゆる植物性乳酸菌）は、多糖生産能を有し、ラッキョウ漬けに優れた乳酸菌として選抜され、ラッキョウ製品の大手メーカーで使用されている。しかしながら、乳酸菌発酵後、ラッキョウの成形残渣および漬け込み発酵残渣は、未活用のまま廃棄されている。 我々は、以前より、乳酸菌および乳酸菌が生産する多糖が、ブタなどの産業動物の免疫能を高める可能性を見出している。このことは、ラッキョウ漬けの工程で大量に廃棄され、乳酸菌や多糖を多く含む上記発酵残渣が、ブタなどの免疫力を高め、減投薬につながる飼料として発展的に利用できる可能性を強く示唆する。さらに、発酵残渣には、アミノ酸をはじめ、肉質向上に有効な成分を多く含むことが予想され、その有効利用が期待される。 【目的】 本研究では、未利用資源としてのラッキョウ残渣および漬け込み発酵多糖残渣について、ブタやウシにおける免疫能を高め、成長を促進するとともに、肉質向上に寄与する飼料化の可能性を検討し、その応用開発を行う。 本年度は、まず、残渣の飼料化のための粉末化の条件検討を行い、ラッキョウ残渣および発酵多糖残渣のブタやウシにおける嗜好性の調査・検討を行うとともに、残渣の成分分析を行い、飼料開発のための安全性、免疫機能や肉質向上性との関連成分に関する基礎情報を得る。さらに、残渣に含まれる乳酸菌および多糖の免疫機能性について、ブタ由来の免疫担当細胞に対する各種免疫応答性を指標として検討し、実証試験につながる基礎を築く。

食資源として極めて重要な畜産動物は，哺乳および離乳期に腸管感染症に罹患し慢性化し易く，生産性低下予防と成長促進のために抗菌剤の大量使用を余儀なくされ，結果として薬剤耐性菌の発生といった二次的被害に対する消費者の不信感が高まった．さらに，畜産動物への抗菌剤使用規制が本格化したことから，抗生剤に頼らない畜産食品生産技術の開発が急務の課題となっている． 本研究は，世界に先駆けて樹立に成功した子豚腸管上皮細胞株(PIE細胞)および牛腸管上皮細胞株(BIE細胞)により，新規畜産動物腸管パイエル板モデル培養系を構築し，安全性が確認されている腸管免疫活性型乳酸菌「イムノバイオティクス」の選抜から，畜産動物の腸管免疫能を強化する，感染性下痢症予防に有効かつ的確な 「イムノバイオティック飼料添加物」の開発を目指す． 本研究の成果は，腸管感染症から畜産動物を守る新規な「イムノバイオティック飼料添加物」の実用化とその普及にもつながり，抗菌剤に頼らない畜産食品生産技術の飛躍的発展と，関連産業における波及効果が大いに期待できる．

我々は，細菌感染防御に重要なパターン認識受容体ファミリーの，ブタ腸管免疫系における発現の詳細と，腸管免疫機能性の乳酸菌（イムノバイオティクス）の活性発現との関連性について解明してきた．最近になって，子ブタ回腸から世界に先駆けて，腸管免疫系の最前線に位置するブタ腸管上皮細胞株(PIE細胞)の樹立に成功した．そこで，PIE細胞とこれまでの知見を融合することにより，パターン認識受容体を介する抗炎症性の的確なブタ腸管分子免疫評価系が構築でき，抗生剤に代わる新たなイムノバイオティクスの選抜から「イムノバイオティック飼料」の創製につながるものとして期待される．． 本研究は，世界に先駆けて樹立に成功した子豚腸管上皮細胞株(PIE細胞)および牛腸管上皮細胞株(BIE細胞)により，新規畜産動物腸管パイエル板モデル培養系を構築し，安全性が確認されている腸管免疫活性型乳酸菌「イムノバイオティクス」の選抜から，畜産動物の腸管免疫能を強化する，感染性下痢症予防に有効かつ的確な 「イムノバイオティック飼料添加物」の開発を目指す． 本研究の成果は，腸管感染症から畜産動物を守る新規な「イムノバイオティック飼料添加物」の実用化とその普及にもつながり，抗菌剤に頼らない畜産食品生産技術の飛躍的発展と，関連産業における波及効果が大いに期待できる．

超高齢化社会の到来により，免疫機能低下者の激増が予測されることから，医薬品とは別に，免疫機能性の健康食品をはじめ特定保健用食品(トクホ)の開発・認可の促進が必要となる．とりわけ，免疫機能性「トクホ」の誕生には，医薬品より安価で簡便に免疫機能性評価が可能なシステム構築が必要不可欠である．そこで，本研究では，齧歯類よりもヒトに近縁のブタをモデルとして，免疫機能性「トクホ」の公的認可のため，とくに，プロバイオティクスの分子免疫機能性評価システムを確立し，提案を行うことを目的とする．ブタは，ヒトとの相同性が齧歯類に比べ非常に高い他，インビトロから，インビボまで容易に評価することが可能である．したがって，得られた評価データは直接ヒトへの効果に反映でき，結果として，ヒト臨床試験の削減にもつながる評価系を確立できる．

【目的】 近年，乳酸菌が有する生物活性を基礎としたプロバイオティク製品などの機能性食品やサプリメントの開発が盛んに行われるようになり，世界中で一大市場を築くまでに至った．最近では，腸管免疫活性に特化したプロバイオティックスがイムノバイオティクスと定義され，その機能性食品もさらに発展することが期待されている．我々は，乳業用乳酸菌の細胞壁成分や染色体ゲノムDNAが腸管免疫調節を誘導することを発見し，特徴的なDNA配列を発見した．このことは，活性因子を有する乳業用乳酸菌が，細菌特異的パターンを認識する受容体であるToll-like receptor(TLR)を介して腸管免疫システムを制御し，疾病予防に寄与する可能性を強く示唆する．本研究は，これまでの知見を基礎とし，乳酸菌由来DNAのTLR9を介する腸管免疫活性評価系を構築し，“アレルギー予防食品”の創製を目指した，戦略的基礎研究を行うことを目的としている． 【結果と考察】 １． AT-オリゴヌクレオチドの免疫活性 AT-ODNがTLR9を介して免疫活性を示すことを検証するため，TLR9を強制発現させた動物細胞株を構築に成功した．本細胞株をAT-ODNで刺激するとTLR9を介する細胞内シグナル伝達系が活性化され，抗アレルギー性サイトカインが産生されることを発見した．以上の解析を通してAT-ODNがTLR9に認識され，抗アレルギー免疫応答を誘導する可能性が考えられた． ２．Toll-like receptor 9の腸管組織における局在性 TLR9の生体における局在性について全身の各組織と腸管の各部位における発現量を比較したところ，パイエル板と腸管膜リンパ節において最も強くTLR9が発現していることを発見した．このことから，TLR9がAT-ODNに対して認識性を持ち，腸管免疫系の活性化に寄与する可能性が十分に考えられ，TLR9をAT-ODNの免疫機能を解明する上で，最重要分子であることを世界に先駆けて提唱した． ３．乳酸菌DNAの免疫活性評価システムの構築 TLR9強制発現細胞株が免疫活性DNAのTLR9を介する①取り込み能，②細胞内シグナル伝達分子の転写活性，③サイトカイン産生量の測定の３段階で検証することで，様々なDNA配列から免疫活性の強い配列を選抜できるため免疫活性評価システムとして価値があり，その応用が期待できる．今後，抗アレルギー食品開発における重要なツールとして利用できることが期待される．

１．乳業用乳酸菌由来DNAによるパイエル板細胞における活性化標的細胞 幼若化活性が認められた5菌株，L. bulgaricus NCFB 1979，NCFB 2074，NIAI yB62， NIAI B6 ，S. thermophilus OLS 3073，L. gasseri JCM 1131TのDNAについてパイエル板細胞におけるCD69の誘導能を解析したところ，CD4/8およびTCRα/β陰性の細胞集団において全ての菌株のDNAが強いCD69の発現誘導を示した．また，CD4/8陽性およびTCRα/β陰性の細胞集団においても，全ての菌株のDNAによりCD69の発現誘導がされた．L. bulgaricus NIAI B6, yB62, NCFB 1979, L. gasseri JCM 1131T, S. thermophilus OLS 3073はCD4/8強陽性およびTCRα/β陽性(R4)の細胞集団に対してCD69の発現を誘導した． L. bulgaricus NIAI B6由来DNAモチーフのOLLB7および陽性コントロールのCpG ODN 1826は全ての細胞集団に対してCD69の発現を誘導したが，特にCD4/8およびTCRα/β陰性，CD4/8陽性およびTCRα/β陰性の細胞集団に対して強くCD69の発現を誘導した． ２．ヒトのモデル系として期待されるブタ腸管におけるIL-7のクローニング 初生仔ブタ腸管由来RNAを調製し，他のほ乳類の配列を基に化学合成したPCRプライマーを用いたRACE法により176アミノ酸配列をコードする531bpからなるORFを含む824bpの塩基配列が明らかとなった．推定アミノ酸配列はヒト，ヒツジ，マウスに対して高い相同性を示し（それぞれ73.3%, 64.7%, 88.6%，また，ヒトと同様にマウスにおいて欠損している18アミノ酸残基(VKGRKPPSLGEAQLTKNL)からなる領域が保存されていた（図１）． ３．腸管パイエル板における菌体およびDNAの通過と免疫細胞結合性 マウス腸管管腔内にFITC標識した菌体およびDNAを入れ，37℃，2時間インキュベートし，パイエル板に取り込まれたFITC標識菌体およびDNAをフローサイトメトリーにより解析した．Cytokeratin-18陽性，Mac-1陰性の細胞集団においてL. gasseri(LG)，L. bulgaricus(LB)がそれぞれ94%, 81%という高い割合で検出された．DNAは全ての細胞集団において特に強く結合する細胞（Fluorescence Intensity >103）が認められ，特にCytokeratin-18陰性，Mac-1陰性の細胞集団においてその傾向は顕著であった． マウス腸管管腔内にFITC標識した菌体およびDNAを入れ，

Lact. lactis ssp. cremorisが生産する幼若化活性物質の本体は，グルコース，ガラクトース，ラムノースを構成糖とし，リンを含むリン酸化多糖であることが判明した．本多糖は，マウスのリンパ球のみならず，ウシ，ブタおよびヒトのリンパ球に対しても，幼若化活性を示す事がわかった．

粘質物産生乳用乳酸菌Lact. lactis ssp. cremoris KVS20およびその粘質物は，in vivoにおいて，細胞障害性マクロファージを誘導し，抗腫瘍性を発現することが明らかとなった．

粘質発酵乳ヴィリーより粘質性乳酸菌を分離・同定し，Lact. lactis ssp. cremoris KVS20と命名した．S-180移植腫瘍系において同菌を連続９日間投与することにより，腫瘍増殖が抑制され，平均生存日数が増加した．また，本菌は腫瘍細胞に対して直接細胞傷害性を示さないことから，この腫瘍活性は宿主免疫機能の増強を介して誘導されるものと考えられた．