本年度研究計画1)p53四量体形成ドメイン変異体cDNAライブラリーの作製とスクリーニングに関して、ランダムオリゴプライマーを用いてMycタグ-p53四量体形成ドメインペプチド(p53TD)およびp53TD-HAタグをコードするcDNAライブラリーをPCR法によって作成し、それらを鋳型にin vitro transcriptionによってmRNAライブラリーを作製した。C-末端にHAタグを含むp53TDをコードするmRINAライブラリーについては、3'-末端にピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチドをT4RNAリガーゼを用いて共有結合させた。これらmRNAライブラリーをHisタグ-野生型p53TDをコードするmRNAとともに、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で同時に翻訳し、合成されたペプチド混合液から、抗His抗体磁気ビーズを用いてHisタグ-野生型p53四量体形成ドメインペプチドと複合体を形成したペプチドを除去し、さらに抗Myc抗体磁気ビーズに結合しないペプチドを除去した。抗Myc抗体磁気ビーズに結合したMycタグ-p53TDペプチドと複合体を形成しているp53TD-HAペプチドのC-末端にピューロマイシンを介して付加しているmRNAを鋳型として、HAタグに対する特異的プライマーを用いて逆転写反応を行った。その後、p53TD-HA領域をコードするcDNAをPCRによって増幅...