水野 健作

力学的刺激に対する細胞応答は生体の恒常性維持、組織形成において重要な役割を担っているが、細胞の力学応答の分子機構の多くは不明である。本研究では、細胞の力覚応答に関与するRho-GEFとして私達が最近同定したSoloの活性化機構を解明し、力覚応答の新たな分子機構を解明するとともに、細胞の集団移動や管腔形成におけるSolo-RhoA系の機能を解明する。

細胞は外界からの力学的刺激（メカニカルストレス）に応答して、形態や運動・増殖能を大きく変化させる。例えば、血管内皮細胞は拍動による繰返し伸展刺激や、血流によるずり応力を受けており、これらの力刺激に応答して細胞の配向性、運動・増殖能を変化させる。また、原腸陥入時の中胚葉の収束伸長や心臓、骨、筋肉などの組織形態形成は、液性因子の作用とともに、外環境の硬さや、細胞間、細胞-基質間に発生する力によっても制御されている。このように力学的刺激に対する細胞応答(力覚応答)は、胚発生、器官形成、血管形成等における組織の発達、維持、再生過程において極めて重要な役割を果たしており、その応答不全は器官形成不全、循環器疾患、骨粗鬆症、癌の悪性化など多くの疾患とも密接に関連している。しかし、外界の力学的刺激を化学的シグナルに変換する分子機構については未だ不明な点が多い。 細胞の力覚応答にはRho ファミリーとアクチン骨格の再構築が中心的な役割を果たしているが、力学的刺激によるRho ファミリーの活性化機構は全く不明である。私達は最近、血管内皮細胞の繰返し伸展刺激による細胞配向変化をモデル系として、約70 種のRho-GEF（Rho ファミリー活性化因子）の網羅的な発現抑制実験を行い、力覚応答に関わる11 種類のRho-GEF を同定する ことに成功した。さらに、同定したRho-GEF の中で、RhoA のGEF であり、ゼブラフィッシュ胚の収束伸長に関与することが示されているSolo に注目して研究を進め、Solo がケラチン繊維(K-8/18)と分子内の複数箇所で結合することを見出した。さらに、Solo は張力刺激依存的な細胞内RhoA の活性化やストレスファイバーの形成・強化に必須であることを明らかにした。 本研究では、Solo がケラチン繊維と複数箇所で結合することから、Solo 分子自身が張力によって構造変化し、活性化するメカノセンサー分子として機能する可能性について検証する。力学的刺激によるRho-GEF 及びRho の活性化機構についてはこれまで全く不明であり、本研究によって細胞の力覚応答の新たな分子機構を世界に先駆けて解明することを目的とする。さらに、細胞の集団移動や管腔形成における張力分布を可視化するとともに、Solo-RhoA 系が力覚応答を介して細胞の秩序ある集団的・組織的挙動を制御する分子機構を解明することを目的とする。

本研究では、NDR経路を中心に、細胞増殖抑制シグナルによる中心体ー基底小体変換機構及び一次繊毛形成機構を解明し、さらに、一次繊毛の形成と崩壊が細胞増殖の制御において果たす役割を解明することを目的とする。そのため、①増殖抑制シグナルによるNDRの活性化機構、②中心体-基底小体変換ならびに一次繊毛形成におけるNDRとその基質の機能、③一次繊毛形成による細胞増殖の制御機構、の３項目に焦点を当てて研究を進める。本研究により、増殖抑制シグナルによる一次繊毛形成の分子機構が解明されるとともに、中心体-基底小体変換という新たな視点から細胞増殖の進行と停止を制御する新機構が解明され、さらに、繊毛病として知られる繊毛形成異常による多様な疾患の分子的理解が大きく前進することが期待できる。

細胞は力学的刺激に応答して形態、極性、運動能、増殖能を大きく変化させるが、物理的な「力」シグナルを化学シグナルに変換するメカノトランスダクションの分子機構の多くは不明である。Rhoファミリーはアクチン骨格の再編成を誘導し、力学的刺激依存的な細胞応答において中心的役割を担っていると考えられるが、力学的刺激によるRhoファミリーの活性化機構は全く不明である。本研究では、①血管内皮細胞の繰返し伸展刺激によるアクチン繊維の再配向、②３次元培養下における上皮細胞のシスト（嚢胞）形成における細胞外基質の硬さ依存的な脱組織化、を力刺激による細胞応答のモデル系として用い、力刺激によるRhoファミリーの活性化と細胞応答の分子機構を解明する。私達は既に上記２つの系に関与する数種のRho-GEFを同定しており、本研究の進展は物理的「力」シグナルを化学シグナルに変換する新たな分子機構の解明に大きく貢献すると考えられる。

アクチン細胞骨格の再構築は、細胞の運動、分裂、極性形成に必須の役割を担っており、器官形成、神経系構築、免疫応答、癌細胞転移など多くの生理的・病理的現象においても重要な役割を果たしている。私達は、アクチン骨格の再構築を制御する主要因子であるコフィリン（アクチン脱重合因子）を特異的にリン酸化（不活性化）するLIMキナーゼ(LIMK)と、脱リン酸化（活性化）するホスファターゼであるSlingshotを同定し、コフィリンのリン酸化・脱リン酸化を介したアクチン骨格制御機構とそのシグナル伝達経路を明らかにしてきた。さらに、LIMKとSlingshotの発現抑制によって、細胞遊走や分裂時の極性形成に異常が生ずることを見出した。しかし、細胞遊走や分裂時のLIMKとSlingshotの時空間的な活性制御機構は不明である。本研究では、細胞遊走時の前後軸形成過程や細胞分裂時の分裂軸決定過程におけるコフィリンの時空間的な活性制御機構を解明し、コフィリンを介したアクチン骨格の時空間的な制御経路が細胞遊走、分裂時の極性形成において果たす役割を解明することを目的とする。

血管新生は、発生過程において重要であるだけでなく、癌転移、粥状動脈硬化、糖尿病性網膜症、関節リューマチなど多くの疾患の発症にも深く関わっている。特に癌組織によって誘導される腫瘍血管新生は、癌細胞の栄養補給や転移に必須の現象であることから、血管新生阻害剤による抗癌治療薬の開発が期待されている。血管内皮増殖因子(VEGF)は、血管内皮細胞の増殖、遊走、管腔形成を誘導する主要な血管新生因子であるが、特に細胞遊走、管腔形成の促進機構については不明の点が多い。私たちは、最近、VEGFによる血管内皮細胞の遊走促進に関わる新たなシグナル伝達経路を見出した(EMBO J., 2006)。本研究では、VEGFによる血管内皮細胞の遊走促進機構ならびに新規シグナル経路の生体内における血管新生機能を解明するとともに、シグナル経路を遮断する薬剤をスクリーニングし、血管新生阻害剤を開発することを目的とする。

ケラチノサイトの運動におけるSlingshotの機能を解析し、Rac1によるコフィリンの脱リン酸化やラミニンの再構築、細胞運動への関与を解明する。

リン酸化コフィリンがホスフォリパーゼD1に直接結合し、活性化する可能性について検討する。

受容体型チロシンキナーゼの下流でSprouty2によるErkの阻害効果に対するTESK1の機能を解析する。

血球細胞の遊走と核変形における細胞骨格の制御機構とシグナル経路の探索

細胞骨格、細胞運動を制御するシグナル伝達機構

SproutyによるTESKのキナーゼ活性、細胞骨格制御機構の解明

Slingshotの細胞遊走、細胞分裂、神経ガイダンスにおける役割の解明

本研究では、LIMキナーゼ(LIMK1,LIMK2)及びその類縁キナーゼであるTESK1,TESK2の細胞骨格制御における役割を解明し、細胞遊走や細胞質分裂におけるコフィリンのリン酸化の役割について研究を行う。

本研究では、Gas6に関連した新規細胞因子を同定することを目的としてPCR、law-stringensy hybridization、databasesearchなど種々のスクリーニングを行う。

本研究者らは、脳神経系に高発現する新規なプロテインキナーゼであるLIMK1を同定した。さらに、LIMKE1は神経細胞の成長円錐に局在し、アクチン細胞骨格系の再構築を制御していることも明らかにした。本研究では、神経突起伸展や退縮過程におけるLIMK1の機能を解明することを目的とする。本遺伝子の欠失が視覚性空間認知という高次神経機能の障害を引き起こすことがヒト遺伝病で明らかにされている点も本研究の特色である。

本研究ではGas6の構造に基づいて新規Gas6ファミリー分子を同定し、その機能を解明することを目的とした。そのために、まず、Gas6の機能ドメインを決定し、このドメインのcDNAをプローブとしてスクローニングを行った。結果的には、新規なGas6ファミリー分子の同定はできなかったが、Gas6の受容体結合領域がC末端部の性ホルモン結合蛋白質（SHBG）様ドメインに有ることを決定し、N末端のGlaドメインはGas6の活性を調節するだけでなく、phosphatidylserineと結合することで細胞接着に関与していることを示唆する結果を得た。

肝細胞増殖因子（HGF)は肝細胞など多くの上皮細胞の増殖を促進し、組織再生、器官形成などにおいて重要な役割を果たしていうることが知られている。最近の研究から、HGFと構造類似した蛋白質HGF-like protein(HLP)の存在や、HGFレセプターであるc-metと相同性の高井受容体型チロシンキナーゼの存在が知られてきた。本研究ではc-metに類似した受容体をクローニングし、そのリガンドとして新規なHGFファミリー分子を同定することを目的として、研究を開始した。

細胞増殖因子や分化因子のレセプターの多くは、細胞内にチロシンキナーゼ構造をもつことが知られている。これまで同定されたチロシンキナーゼ型レセプターの中には、そのリガンドが不明の物も多数存在しており、これらのリガンド分子の同定は、未知の細胞間情報伝達分子の解明に繋がるつながる重要な課題である。 われわれは、最近、脳に特異的に高発現する新規なチロシンキナーゼ型レセプターSkyのヒト及びラットのcDNAクローニングに成功し、その全構造を決定した。Skyは、細胞外ドメインにNCAMやファシクリンⅡなどの神経細胞接着因子（NCAMs)の細胞外ドメインと類似したイムノグログリン様（If-like)構造とフィブロネクチンタイプⅢ（FNⅢ）構造を持ち、Axl、Merとともに受容体型チロシンキナーゼの中で１つのサブファミリーを形成している。Skyは、脳に特異的に高発現していることから、脳神経系において神経細胞の接着や伸展、生存維持のシグナルの受容体として機能をはたしていると考えられる。 本研究では、Skyのリガンドを解明し、その生理機能を明らかにする。

Hepatocyte growth factor (HGF) is biosynthesized as a single-chain precursor (pro-HGF) and is proteolytically processed to a two-chain mature form. When MRC-5 fibroblasts were pulse-radiolabeled under serum-free conditions, pro-HGF was the predominant molecular form of HGF in the culture medium. CHO cells transfected with an expression plasmid containing a full-size human HGF cDNA produced pro-HGF when these cells were cultured in serum-free medium. These findings suggest that HGF is secreted as a pro-form, which is then converted to a two-chain form by extracellular protease. Single-chain HGF exhibited mitogenic activity on cultured hepatocytes, with a potency similar to that of mature HGF, but this activity was remarkably inhibited by leupeptin. We postulate that inactive pro-HGF is converted to an active two-chain form by a leupeptin-sensitive serine-protease expressed by hepatocytes. Neither plasminogen activators nor plasmin showed any processing activity of pro-HGF in vitro.