上野 秀一

Dcp1-EGFPを指標に透明化割球内におけるP-bodyの局在変化を調べた。MBT以前（Fig1A）ではP-bodyは細胞全体に均一に発現していたが、MBT以降には顆粒状（培養細胞で報告されているP-body様の構造）に局在し始めた（Fig1B）。<br>また、P-body（断面積0.5μ㎡以上と定義）の数とサイズはMBT以降で細胞周期の伸長と共に増加していた（Fig2）。このことは、MBT以降に出現し増加するP-bodyによりmRNAの分解が行われている可能性を示唆している。

Dcp1-EGFPを指標に透明化割球内におけるP-bodyの局在変化を調べた。MBT以前（Fig1A）ではP-bodyは細胞全体に均一に発現していたが、MBT以降には顆粒状（培養細胞で報告されているP-body様の構造）に局在し始めた（Fig1B）。<br>また、P-body（断面積0.5μ㎡以上と定義）の数とサイズはMBT以降で細胞周期の伸長と共に増加していた（Fig2）。このことは、MBT以降に出現し増加するP-bodyによりmRNAの分解が行われている可能性を示唆している。

（目的） 多くの多細胞生物は形態形成のために適切な時期と位置で細胞移動を行うが、細胞分裂期（M期）には細胞は移動出来ない。ツメガエル胚のMBT（中期胞胚遷移）期は細胞増殖から形態形成への変遷期となるため、形態形成（細胞移動）を開始するために細胞周期を協調的に制御する機構が存在すると考えられる。本研究では生きた胚の細胞内観察を透明化割球と作成予定の部分透明化胚を用いることで可能にし、MBT後の原腸陥入や神経胚形成時の移動中の細胞における細胞周期制御因子の細胞内局在変化の必要性を解析することが出来る。<br>（実施状況） 細胞周期制御因子の機能阻害実験、蛍光タグによる局在観察実験のための各種mRNAを作製している。既に透明化割球にEGFP-PTENを発現させた予備実験でMBT期以降の細胞内での局在変化を確認している。また、生きた細胞での細胞周期の位相を特定する実験系の作成も進めている。<br>（成果等） 初期胚では細胞周期の伸長に伴い大きく位相も変化する。これまでに、生きた割球（透明化割球）でMBT期前後の細胞周期がG2、G1期の出現とS,G2,G1期の伸長によって起きることを報告している。また、細胞周期制御因子であるPTENの細胞内での局在変化（核と細胞膜近辺）により細胞周期の伸長が助長され、その直後の形態形成過程である原腸陥入に必要であることを初めて明らかにした。<br>

MBT期でのPTENの核移行の分子機構を明らかにする<br> 近年、PTENの核移行は正常細胞（癌化していない細胞）において細胞周期制御に必要なことが示唆されている。一方、ツメガエル胚ではMBT期以降にPTENの明確な核移行が起きており（2006年論文発表）、PTENの核移行は細胞周期の制御と形態形成開始の協調性に重要な意味を持つと考えられる。そこでPTENの核移行に必要な分子の探索も含め解析を行う。<br> 形態形成における細胞移動の開始・停止とPTENの局在・機能の関係を明らかにする<br> 原腸陥入などの形態形成過程では特定の細胞が移動する。これまでは固定組織においてPTENの局在を確認してきた。しかし、形態形成時の生きた細胞内におけるPTENの局在化が細胞移動のどの時点に必要かは不明のままである。この関係を明らかにすることで、細胞移動の前提としてPTENによる細胞周期抑制が必要なのか（つまり、移動する細胞はすでにG1期に維持されている）、形態形成のシグナルを受け取った細胞がG1期に維持されるのかを明確にできる。実験には既に確立した透明化割球の実験系、及び本研究で作成する透明化胚（動物極側、外胚葉が透明）を用いる。この系では生きた胚の細胞内におけるPTENの挙動を解析できる。<br> 既知の形態形成のシグナル経路とPTENの関係を解析する<br> 原腸陥入時の細胞移動（CE；Convergent Extension）に関してWnt経路の１つであるPCP経路の解析が報告されている。しかし、細胞移動の極性に関する知見の多さに対し、細胞の運動性の変化に対する報告は少ない。そこでPTENの細胞周期抑制による細胞の運動性の獲得がPCP経路の下流で行われている可能性を明らかにする。<br>

透明化割球の作成条件を既に確定している。一方、当研究室でのPI3KおよびPTENの過剰発現の実験などからツメガエルの初期発生、とりわけ原腸胚形成に両遺伝子の必要性が示唆されている（PTENに関する論文、投稿中）。原腸胚の形成では著しい細胞移動が起きていることから、両遺伝子が同時期の細胞移動に関与することが考えられる。更に同様の処理をした胚から単離した割球等を用いて、細胞周期の伸長と細胞移動の開始の移行に関する機構を調べようとしている。

透明化割球の作成条件を既に確定している。また、各種組織（外胚葉性）への分化条件を検討中である。一方、当研究室でのPI3KおよびPTENの過剰発現の実験などからツメガエルの初期発生、とりわけ原腸胚形成に両遺伝子の必要性が示唆されている。原腸胚の形成では著しい細胞移動が起きていることから、両遺伝子が同時期の細胞移動に関与することが考えられる。更に同様の処理をした胚から単離した割球を分化させた組織にどのような変化が起きるか確かめる実験を準備中である。

本研究ではツメガエルの初期発生過程において、発生の進行に不可欠な細胞周期の非同調化の機構の解析を行う。また、この非同調化が細胞核と細胞質の比率の変化に依存することから、核と細胞質に存在している非同調化を規定する因子の探索を行う。方法としては手始めに非同調化因子の候補となる細胞周期制御因子CyclinB1を蛍光蛋白質GFPに結合させたmRNAを作成する。次に作成したmRNAをツメガエル受精卵に注入して発現させる。その胚を透明化させてCyclinB1-GFPの蛍光観察を行い、その挙動が細胞周期の非同調化と関連しているかを細胞内における量や局在の変化をリアルタイムで測定することで調べていく。