矢野 雅文

（研究計画）pVTの突然変異部位を含む合成ペプチド(Domain peptide:DPc10：N-terminalとCentralのドメイン連関障害を惹起)を用いて、pVTや心不全時のRyR機能異常の機序を解明し、心不全治療に応用する。<br>（実施状況）１）正常RyR において、DPc10およびFK506（RyRからFKBP12.6を解離させる）はいずれもN-terminalとCentral間のドメイン連関障害を引き起こし、その結果、Ca2+ leakや心筋細胞の収縮障害をもたらした。２）不全心RyRではすでにドメイン連関障害をきたしており、正常RyRにDPc10を添加した際の変化に酷似していた。３）RyR安定化薬のJTV519はRyRのドメイン連関障害を是正することにより、RyRからの異常なCa2+ leakを抑制し、不全心筋細胞の収縮機能障害を是正した。<br>（結語）新しい心不全治療戦略としてのRyRチャネル安定化の詳細な機序が明らかとなった。今後は”細胞内Ca2+ overloadの是正”という観点からRyRチャネル安定化を治療ターゲットとする新しい慢性心不全治療および不整脈治療の展開が期待される。

（研究計画）pVTの突然変異部位を含む合成ペプチド(Domain peptide:DPc10：N-terminalとCentralのドメイン連関障害を惹起)を用いて、pVTや心不全時のRyR機能異常の機序を解明し、心不全治療に応用する。<br>（実施状況）１）正常RyR において、DPc10およびFK506（RyRからFKBP12.6を解離させる）はいずれもN-terminalとCentral間のドメイン連関障害を引き起こし、その結果、Ca2+ leakや心筋細胞の収縮障害をもたらした。２）不全心RyRではすでにドメイン連関障害をきたしており、正常RyRにDPc10を添加した際の変化に酷似していた。３）RyR安定化薬のJTV519はRyRのドメイン連関障害を是正することにより、RyRからの異常なCa2+ leakを抑制し、不全心筋細胞の収縮機能障害を是正した。<br>（結語）新しい心不全治療戦略としてのRyRチャネル安定化の詳細な機序が明らかとなった。今後は”細胞内Ca2+ overloadの是正”という観点からRyRチャネル安定化を治療ターゲットとする新しい慢性心不全治療および不整脈治療の展開が期待される。<br> <br><br>

研究計画・方法 ビーグル犬を用いて、ハロセン麻酔下で植え込み型圧transducerを左室内に、また一対の超音波クリスタルを左室前壁自由壁に装着し、２週間の安静期間後に、埋め込み型ペースメーカーを用いて高頻度右室ペーシング（２５０／分）を開始する。ペーシング開始直後よりβ遮断薬（プロプラノロール）を持続注入ポンプを用いて低用量、または高用量を慢性投与し、意識下で一週ごとに血行動態（左室圧、左室内径）を測定、薬剤非投与群と比較検討する。β遮断薬の用量は、正常犬に一週間慢性持続投与しイソプロテレノールに対する、左室圧の最大変化速度（+dP/dt）を１０％程度抑制する量を低用量、４０％程度抑制する量を高用量とする。<br> 次に、ペーシング４週後に屠殺し、心筋からSRを含むミクロソーム分画を精製した後、以下の点についてβ遮断薬の効果を検討し、β遮断薬慢性投与時のSRを中心とした細胞内Ca2+動態に及ぼす効果を検討する。<br> <br>１）RyRからの急速なCa2+ 放出:現有のストップドフロー蛍光装置を用い、msecの時間単位のCa2+放出能を測定する。心不全では、Ca 放出トリガーであるポリライシンによるCa2+放出速度が著明に低下している。<br>２）RyRからのCa2+ leak: ＳＲvesicleを含むpriming solutionにATPを添加しfluo 3による、extravesicular [Ca2+]の経時的変化を現有のHITACHI分光高度計を用いて記録する。Ca2+取り込みがプラトーに達した後、1 &＃61549;M thapsigargin（Ca2+-ATPaseの特異的阻害薬）を加えて、その後のCa2+ leakを測定する。FK506 (FKBPにspecificに結合し、FKBPをRyRから解離させる)を添加すると、正常心ではFK506の濃度依存性にCa2+ leakを生じるのに対し、心不全ではFK506を加えずとも明らかな自発的なCa2+ leakがみられており、FK506によるさらなる変化を認めない。即ち、正常心ではFKBPはRyRに結合して存在するが、不全心ではすでにRyRから解離していることを示している。<br>３）RyR構造変化: RyRに特異的に結合するポリライシンを媒体として使用し、クロスリンカー、SAED:sulfosuccinimidyl 3((2 (7-azido-4- methylcoumarine3 acetamide)ethyl)dithio) propionateによるRyRの蛍光色素によるラベルを行う (J Biol Chem 270:3017, 1995)。上述のCa2+ leakを生ずる同一条件において、SAED中methylcoumarine acetamide(MCA)の蛍光強度の変化(励起 3