1.分子シャペロンのアセチル化
本研究ではHsp90のコシャペロンの一つであるactivator of Hsp90 ATPase(Aha1)をアセチル化タンパク質として同定した。Aha1のアセチル化部位はN-末端領域のlysine-3であり、アセチル化酵素はCBPおよびTIP60、脱アセチル化酵素はHDAC6およびSIRT1/2であった。HDAC6ノックダウンによりAha1のアセチル化レベルが顕著に増加したことから、特にHDAC6によるAha1の脱アセチル化を詳細に解析した結果、Aha1は熱ショックやプロテアソーム阻害などの刺激によりHDAC6との結合が解離し、アセチル化が亢進することが判明した。Hsp90もHDAC6により脱アセチル化修飾を受けることが報告されており、このことからHsp90:Aha1複合体がHDAC6による機能調節を受けることが考えられた。実際、Hsp90とAha1の結合はアセチル化によつて阻害され、またAha1によるHsp90活性化もアセチル化により抑制された。以上から、nDAC6によるアセチル化調節はHsp90のみならず、Aha1にも起こり、Hsp90複合体の活性を調節していることが明らかになった。
2.アクチン結合タンパク質のアセチル化
アセチル化タンパク質の探索の結果、アクチン結合タンパク質cortactinを同定した。CortactinはF-actin結合ドメインを有し、アクチン形成に重要な役割を担っている。MS解析によりアセチル化部位はF-actinとの結合に必須なcortactin repeat領域であることが判明した。このリピートドメインは6+1/2の繰り返し配列からなり、7カ所のlysine(lysine-87/124/161/198/235/272/309)が全てアセチル化されることを確認した。HAT過剰発現によるin vivoアセチル化を調べたところ、アセチル化酵素はCBPであることが示された。また、同様の方法により脱アセチル化酵素がclass III HDACであるSIRT1であることを明らかにした。Cortactinは細胞質に局在するタンパク質であるにも関わらず、そのアセチル化/脱アセチル化酵素が核タンパク質であったことから、cortactinが核・細胞質間をシャトルしている可能性が考えられた。そこで核外輸送タンパク質CRM1の特異的阻害剤であるレプトマイシンB(LMB)を処理し、cortactinの局在を観察したところ、cortactinは核に蓄積した。さらに、LMBを処理したHeLa細胞ではSIRT1ノックダウンにより顕著にアセチル化が亢進したことから、cortactinが核内でアセチル化、脱アセチル化修飾を受けることが示された。また、アセチル化部位はF-actin結合ドメインであったことから、アセチル化部位の変異体を用いてF-actin結合実験を行った。その結果、アセチル化はF-actinとの結合を阻害することが判明した。shRNAベクターを用いてcortactinをノックダウンした後、WTおよび7KR,7KQ変異体を過剰発現させた安定発現細胞を作製し、運動性をboyden chamber assayにより測定した。その結果、WTに比べ7KQでは顕著に運動性の低下が観察された。以上から、cortactinのアセチル化はF-actinとの結合を阻害し、細胞の運動性を低下させることが明らかとなった。